针对甲型流感病毒具有广泛反应性的人抗体谱系的独特结合模式
目前，甲型流感病毒（IAV）感染对全球公共卫生健康造成了严重和持续的威胁。由于流感病毒的抗原漂移，目前的季节性流感疫苗不足以抵御病毒感染，同时，抗药性流感病毒也限制了抗病毒药物的使用。近日，有研究从一名接种了三价季节性疫苗的健康志愿者者身上分离出天然的人类抗体谱系，其中代表性抗体28-12在体外对Group1及Group2的IAV病毒表现出广泛的中和活性，并可保护小鼠免受H3N2和H1N1病毒感染。这些人类抗体谱系（28-2、28-4、28-6和28-12）均属于携带VH3-48/DH2-2/JH6和VK1-12/JK5基因片段的同一谱系。28-12对异型抗原的识别模式较独特，冷冻电镜和生化分析揭示了该类抗体通过不同的抗原识别模式结合不同亚型的HA蛋白，抗体在不同亚型之间显示出不同的表位决定因素，它们主要结合H3N2 HA的连续表位，同时以构象依赖模式识别H1N1 HA。相关研究以题为Unique binding pattern for a lineage of human antibodies with broad reactivity against influenza A virus在线发表于Nature communications。
首先，作者通过单细胞PCR实验从一名接种季节性三价流感疫苗四周后的健康志愿者的记忆B细胞中筛选可能预防异亚型IAV感染的mAb。由于H1N1和H3N2亚型是最流行的流行毒株，作者使用可溶性HA蛋白和人感染病毒HK/68 H3N2和SC/09 H1N1（A/Sichuan/01/2009）进行了抗体的克隆和反应性筛选，从而鉴定出一系列对H1N1和H3N1具有不同水平交叉反应性的抗体。在这些抗体中，11个mAb交叉中和H3N2和H1N1。值得注意的是，28-4和28-12显示出更好的交叉中和活性，IC50低于2μg/ml，这与先前报道的抗体MEDI8852相当。使用IMGT和IgBLAST对分离的抗体进行基因序列分析，结果显示大部分抗体利用了VH3-48种系基因，其中28-2、28-4、28-6和28-12属于同一谱系，携带具有跨组中和活性的VH3-48/DH2-2/JH6和VK1-12/JK5基因片段。作者将28-2、28-4、28-6和28-12抗体命名为VH3-48/VK1-12谱系抗体。
随后，作者使用不同的流感毒株对VH3-48/VK1-12谱系抗体与MEDI8852的体外中和活性和广度进行比较，发现所有VH3-48/VK1-12系抗体均能中和H3N2 (A/香港/01/1968和A/江西-东湖/312/2006)和H1N1 (A/四川/01/2009和A/加州/07/2009)病毒。但除MEDI8852和28-12抗体外，其余抗体均不能中和A/Shanghai/02/2013型H7N9病毒。
作者进一步对28-12在小鼠体内进行保护研究。在给小鼠使用不同剂量的28-12（30、10、3或1mg/kg）后用致死剂量的H1N1和H3N2病毒进行感染。结果发现，低剂量28-12即可完全保护小鼠免受H1N1或H3N2感染。为了评估28-12的治疗效果，作者在小鼠感染SC/09 H1或HK/68 H3病毒后的不同时间点使用28-12（25mg/kg）。数据显示，在感染HK/68 H3后第2天用28-12治疗可保证所有小鼠存活，而延迟3天治疗的存活率达到80%。在SC/09 H1的感染模型中，感染后1或2天用28-12治疗可使80%或100%的小鼠存活，而当延迟3天后使用28-12抗体进行治疗，仅观察到40%的存活。以上结果表明，28-12可以在体内广泛保护小鼠免受H1N1和H3N2病毒的侵害。
上述结果表明VH3-48/VK1-12谱系抗体主要通过靶向HA的连续表位来中和H3N2，并与H1N1的构象表位进行反应。为了研究其独特识别模式的结构基础，作者通过冷冻电镜对28-12 Fab与HA复合物的结构进行测定。 结果表明，28-12 Fab特异性识别H3和H1的保守HA茎区，将构成H3或H1上28-12 Fab表位的氨基酸分为两部分：HA2螺旋A内的氨基酸，以及融合肽和HA1内的氨基酸。结果显示28-12与H1和H3 HA的结合模式在某种程度上是不同的，28-12与H1中的融合肽和与螺旋A相邻的HA1残基形成了比H3中的更多的接触。
为了进一步确认组成28-12结合H3的表位的关键残基，作者对H1和H3之间的HA2残基36-57进行了序列比对，并鉴定了6个差异的残基。合成这6种具有从H3到H1的单点突变的肽并将其与野生型肽进行比较，结果显示当HA2的49位从N突变到T时，结合能力显著降低，但其他单一突变不影响结合。说明H3 N49HA2，而不是H1 T49HA2与28-12的HCDR3残基Y108和V109相互作用强烈，具有氢键和更多的原子间接触。以上结果表明，螺旋A的N49HA2残基对于28-12与H3的连续抗原表位的结合至关重要，并进一步表明了H1和H3亚型之间HA蛋白的不同表位特征用于抗体结合。
为了确定28-12的未突变共同祖先（UCA）如何进化以实现不同的识别模式，作者分析了28-12的体细胞突变在VH中携带8个氨基酸替换和VL中携带9个氨基酸替换的作用。结果发现，28-12的生殖种系（GHGL）与H3N2反应，但未能识别H1N1，表明UCA抗体最初可能已被H3N2病毒选择。28-12识别需要重链和轻链中的体细胞突变，轻链突变占主导地位，而重链显示出次要但不可或缺的作用。之后作者将体细胞突变为具有单个氨基酸替换的种系序列。轻链第32、53、92位和重链第114位的体细胞突变显著降低了与H3N2的结合活性。这些发现表明，28-12的胚系抗体最初是由Group2 H3亚型流感病毒选择而来，并通过体细胞超频突变不断进化，从而增强了对H3的中和性，并同时获得对Group1 H1病毒的交叉中和活性。
总之，该研究发现了一类新的胚系基因编码的流感病毒广谱中和抗体，其可以中和Group1及Group2流感病毒，该类抗体会通过不同的抗原识别模式结合不同亚型的HA蛋白，这类抗体获得了广谱中和活性的进化路径，该研究提升了人们对流感抗体广谱中和表位和分子机制的理解，并为广谱流感疫苗和抗病毒药物的开发提供了新思路，提示通用流感疫苗开发过程中应深入评估不同流感病毒亚型之间的表位特征差异。
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